野生紫灵芝S2组织分离与出芝试验研究

1 材料与方法1.1 供试菌株S1、S2、S3、S4为武平县两叶山野生分离株，X5（CK）为武平主栽品种。 1.2 试验培养基1.2.1 母种培养基马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH6.5。 1.2.2 原种及栽培介质杂木屑70%、麸皮25%、玉米粉3%、石膏粉1%、蔗糖1%。它们都是按照常规方法制成的，天然酸碱度和含水量为55%-60%。 1.3 试验方法试验地点在武平县下坝乡鲁面村。 1.3.1 组织分离将采集到的4株野生灵芝带回实验室，用无菌水快速清洗，用无菌纸擦干，然后用75%酒精表面消毒，放入准备好的20mm200mm将试管PDA斜面培养基和单独的接种工具置于接种箱内30分钟消毒，按无菌操作要求挑取0.1-0.2cm白色组织片，接种于PDA斜面中央组织培养。从每个野生灵芝（S1、S2、S3、S4）中分离出5 个试管。吸头3次纯化后，比较菌丝生长情况。 1.3.2 室内筛选对获得的有效菌株进行菌丝耐温培养、菌丝生长及形态观察试验，剔除菌丝生长较弱的菌株。 1.3.3 灵芝试验灵芝试验是鉴别分离菌株是否为灵芝菌株最直接的方法。 2003年12月至2004年9月，对4株分离优化的野生菌株S1、S2、S3、S4进行短段木熟料培养试验，每株用菌材150kg（30袋，约5公斤每袋）蘑菇材料）。经试验证明，4株分离菌株均为灵芝菌株。 1.4 实验设计1.4.1 稳定性观察选取野生株S1、S2、S3、S4培养子实体组织进行分离，纯化后连续传代10次，每株转5管，培养在25C 的恒定温度下。观察并记录菌落特性，菌丝生长速度，生长量等。 1.4.2 抗逆性温度适应性：将供试菌株接种于PDA平板（90mm）培养基中，接种块菌丝朝上，置于25培养箱中培养。当菌落直径长到1cm时，在菌落边缘画一条线作为生长起始线。然后将这些培养皿分别置于10、15、20、25、30、35、40、45进行培养，每个处理5个培养皿，将处于生长最快温度的培养皿快装满时取出，在菌落边缘画一条终止线，用尺子测量起始线和终止线之间的距离，计算生长速率菌丝体生长，取其平均值得到菌丝体生长的最适温度。将不能生长的培养皿移至适宜温度4-7天。能继续生长的原始温度为生长极限温度，未发芽培养皿处的温度为致死温度。 pH值适应性：用0.5mol/LHCl或0.5mol/LNaOH进行pH调节试验，记录将两个容器的pH值（pH值）调节至4.0、5.0、6.0、7.0所需的HCl或HCl。 8.0, 9.0, 10.0 NaOH的量，然后调节每个锥形瓶培养基的pH值，然后立即制作平板培养基，插入待测菌株，置于25培养箱中培养。当菌落直径长到1cm时，在菌落边缘画一条线作为生长的起始线，继续培养。当生长最快的pH值的培养皿快要装满时，取出，在菌落边缘画一条终止线，用尺子测量起始线和终止线的距离，计算出细菌生长速度。丝的生长速率取平均值，得到菌丝生长的pH范围和最适pH。每次pH 处理重复5 次。 品种对比试验：将分离优化的4个野生品系S1、S2、S3、S4进行短节木熟料栽培扩大试验，以当地主栽品种X5为对照，加工后的副料栲栲属。栽培材料选用板宽3-20cm，材料新鲜，树皮多，含水量40%-45%，剪成28-30cm长备用。每个品种1100kg（220袋，5.0-5.5kg/袋，1100kg菌材折成1m3），装袋杀菌，然后接种不同等量的菌种，待菌材成熟后覆土栽培.每个菌种培养试验菌材用量220袋，每55袋分成一组，设4个重复，收获时计算每小区产量，以总产量进行比较。观察记录不同菌株的母种、原种和栽培种的菌丝生长速度和活力。观察不同品系子实体柄和菌盖的生长时间、孢子粉喷出期和产孢量、采收期，采收后晒干，统计产量，计算晒干率。

2 结果分析2.1 稳定性观察表明：4次转管后，S1、S2菌株的生长速度始终稳定，并有加速的趋势。丝绸稀疏且不稳定。 2.2 抗逆性2.2.1 温度由表1可知，两株菌丝生长温度范围为8-35，最适生长温度为25-30。表1 紫芝S2和X5(CK)菌株在不同温度下菌丝生长率比较(cm/d)菌株10 15 20 25 30 35 40 45 S2 0.22 0.28 0.55 0.83 0.68 0.26 00X5 0.22 0.23 0.50 0.75 0.54 0.25 002.2.2 pH值由表2可知，两株菌株适宜的pH为4.0-6.0。表2 紫芝S2和X5(CK)菌株在不同pH条件下菌丝体生长率比较(cm/d) 菌株4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0S2 0.51 0.58 0.52 0.32 0.21 0.06 0X5 0.53 0.55 0.50 0.40 0.16 与野生比较0.菌株菌丝生长情况(表3) 菌株培养试验结果表明：5株供试菌株菌丝呈白色匍匐状，顶端整齐，爬壁性轻微，生长良好。 S1、S2、S4菌丝生长较快，在试管PDA斜面培养基上9天充满；其次是S3、X5，在试管PDA斜面培养基上充满10天。原种和栽培种上，S1和S2生长速度最快，25d满瓶（袋）；其次是S3、S4、26d整瓶（袋）； X5生长速度最慢，27d满袋，但菌丝粗壮。表3 不同灵芝菌株菌丝体生长速度和生长势比较菌丝体满瓶时间/d菌数

母种 原种 栽培种 菌丝长势（栽培种） S1 　9　　27　　25　菌丝白色、生长旺盛、长势有力、尖端整齐、长速较快 S2　 9　　25　　25　菌丝较白、粗壮、较密、生长势好、尖端整齐 S3　10　　26　　26　菌丝较白、稀疏、纤细、长势一般 S4　 9　　25　　26　菌丝较白、密、粗壮、尖端整齐 X5　10　　28　　27　菌丝白色、较粗壮、浓密、生长较慢、尖端整齐　　2.4 子实体产量及形态特征 品比出芝试验（表4）中表明：产量最高的是S2菌株，平均产量25.36kg/m3，对照菌株X5产量23.12kg/m3，比对照增产9.69%。S1产量居第二，当年平均产量23.84kg/m3，比对照增产3.11%。S3、S4两个菌株产量均低于对照X5，分别减产8.09%和11.42%。产量依次为S2＞S1＞X5＞S3＞S4。　　表4 不同灵芝菌株特征与产量比较　　　子实体 菌盖直 菌盖中心 菌柄长 菌柄直 当年平均产菌株　 色泽　径/cm　厚度/cm　度/cm　径/cm　量/(kg·m3) 位次 S1 　紫黑色 5-20  1.0-2.12　5-15　 1.0-1.5　23.84　　　2 S2 　紫褐色 8-30 1.25-2.53 5-15.9  1.2-2.1　25.36　　　1 S3 　紫黑色 9-22　1.15-2.0  5-10　 1.0-1.5　21.25　　　4 S4 　紫黑色 5-26　1.15-1.8　5-14   1.2-1.5　20.48　　　5X5(CK)紫褐色 5-28 1.12-2.35 5-12.35 1.2-1.8　23.12　　　3　　X5子实体生长时间较长，产孢期较长；S2、S3生长时间与产孢期较为接近（表5）。不同菌株的菌盖菌柄中生，少数偏中生，均有似漆样光泽。　　其中，供试菌株（表4）菌盖多为圆形或近圆形，极少呈心形，S1、S2、S3、S4为紫褐色至紫黑色，菌盖略薄但较硬实，表面平整，皮壳较光亮（擦去孢子粉后），中间稍凹陷，同心环纹较疏，放射状纵皱明显；多数直径在12-21cm，中心厚1.0-2.53cm；菌柄中生，少数侧生，柄长5-15.9cm。　　表5 不同灵芝菌株子实体生长发育时间（d）　 菌号　　　 S1　　S2　　S3　　S4　　X5菌柄生长期　18-22 15-20 15-20 20-25 25-30菌盖生长期　22-26 20-25 20-25 20-25 30-45子实体生长期40-48 35-45 35-45 40-50 55-75产孢期　　　15-20 15-20 15-20 15-20 18-22

图1 灵芝S2菌株出芝场景

　　X5（CK）（表5）菌盖为近黑色，菌盖厚但较为松软，表面略为不平整，漆状光泽明显，同心环纹细密均匀；多数直径为15-27cm，中心厚1.12-2.35cm；菌柄中生，少数侧生，柄长5-12.35cm。随机抽取供试灵芝鲜子实体1kg，将其烘干至恒重，折干率在41.5%-45.67%，其中S1折干率为41.5%，S2折干率为45.67%，S3折干率为42.6%，S4折干率为41.5%，X5（CK）折干率42.15%。　　3 小结与讨论　　出芝试验证明：从野生灵芝中所分离的4株菌株子实体形态与野生灵芝形态相符。分离菌株菌丝在pH4-6范围内生长良好，最适pH为4.0-6.0。温度范围8-35℃，最适生长温度25-30℃。　　栽培产量最高的是S2菌株，当年平均产量25.36kg/m3，对照菌株X5产量23.12kg/m3，比对照增产9.69%。S1产量居第二，当年平均产量23.84kg/m3，比对照增产3.11%。S3、S4两个菌株产量均低于对照X5，分别减产8.09%和11.42%。产量依次为S2＞S1＞X5＞S3＞S4。　　形态特征：菌盖多为圆形或近圆形，极少呈心形，S2子实体紫褐色，S1、S3、S4紫黑色，均有似漆样光泽，菌盖直径5-30cm，中心厚1.0-2.53cm；菌柄中生，少数侧生，柄长5-15.9cm。　　为筛选优良菌株，有待进一步做多点试验。